Editado por Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Califórnia, aprovado em 25 de dezembro de 2020 (revisado em 25 de outubro de 2020)
Relatamos a interação entre subunidades na replicação de complexos de transcrição de coronavírus, que são essenciais para replicação e conservação evolutiva.Fornecemos evidências de que o domínio NiRAN associado ao nsp12 possui atividade de transferase de nucleosídeo monofosfato (NMP) em trans e identificamos o nsp9 (uma proteína de ligação ao RNA) como seu alvo.NiRAN catalisa a ligação covalente da porção NMP ao terminal amino conservado nsp9 em uma reação que depende de íons Mn2+ e resíduos Asn conservados adjacentes.Verificou-se que a atividade do NiRAN e a NMPilação do nsp9 são essenciais para a replicação do coronavírus.Os dados permitem-nos ligar esta actividade do marcador enzimático do vírus nested às observações anteriores na hipótese de que o início da síntese de ARN numa classe de vírus de ARN é funcional e evolutivamente consistente.
A RNA polimerase dependente de RNA (RdRps) de Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae e 12 outras famílias) está ligada ao domínio amino-terminal (N-terminal) na proteína não estrutural (nsp) liberada da poliproteína, chamada NiRAN 1ab é composto pela protease principal viral (Mpro).Anteriormente, a própria atividade de GMPilação/UMPilação do vírus arterial NiRAN-RdRp nsp foi relatada e foi sugerido gerar um transiente para a transferência de nucleosídeo monofosfato (NMP) para o vírus (atualmente desconhecido) e/ou coisas de biopolimerização celular.Aqui, mostramos que o coronavírus (Coronavírus Humano [HCoV] -229E e Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) tem atividade de NMPilação dependente de Mn2+, que é derivada de nsp9 através da formação de nsp9 mediada por Mpro. o nsps flanqueador do terminal N é liberado proteoliticamente, o fosforamidato é ligado à amina primária (N3825) no terminal N do nsp9.O trifosfato de uridina é o nucleotídeo preferido nesta reação, mas o trifosfato de adenosina, o trifosfato de guanosina e o trifosfato de citidina também são co-substratos adequados.Estudos de mutação usando proteínas nsp9 e nsp12 de coronavírus recombinantes e mutantes HCoV-229E geneticamente modificados determinaram os resíduos necessários para NMPilação de nsp9 mediada por NiRAN e replicação de vírus em cultura celular.Os dados confirmaram a previsão de resíduos do sítio ativo NiRAN e determinaram o importante papel dos resíduos N3826 da nsp9 na NMPilação da nsp9 e na replicação do vírus in vitro.Este resíduo faz parte da sequência conservada do tripéptido NNE N-terminal e provou ser o único resíduo invariante de nsp9 e seus homólogos na família dos coronavírus.Este estudo fornece uma base sólida para o estudo funcional da atividade de NMPilação de outros vírus aninhados e propõe possíveis alvos para o desenvolvimento de medicamentos antivirais.
O vírus de RNA de fita positiva Nidovirales infecta uma variedade de vertebrados e invertebrados (1, 2).A ordem inclui atualmente 14 famílias (3), das quais a família Coronavírus tem sido extensivamente estudada nos últimos 20 anos.Naquela época, três coronavírus zoonóticos emergiram de hospedeiros animais e causaram surtos em larga escala de infecções respiratórias graves em humanos.Incluindo pandemias persistentes causadas por doenças infecciosas agudas graves.Síndrome Respiratória Coronavírus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Os nidovírus compartilham uma organização genômica comum, e a subunidade do complexo de replicação-transcrição ligado à membrana (RTC) é codificada nos dois terços do terminal 5-?² e na subunidade estrutural principal da partícula do vírus, bem como alguns acessórios .Proteína, codificada no terço final 3??² do genoma (1).Exceto por uma família de vírus planários (Monoviridae) (8), todos os vírus aninhados codificam subunidades RTC em dois grandes quadros de leitura abertos (ORF) ORF1a e ORF1b, que são traduzidos do RNA genômico de.ORF1a codifica a poliproteína (pp) 1a, e ORF1a e ORF1b codificam conjuntamente pp1ab.Com a participação geral da protease principal (Mpro) codificada pela ORF1a, tanto pp1a quanto pp1ab são processados proteoliticamente em uma variedade de proteínas não estruturais (nsps), também conhecidas como 3CLpro, por possuir homologia com a 3Cpro do picornavírus ( 9).Acredita-se que esses nsps sejam montados em um grande RTC dinâmico, catalisam a síntese de RNA genômico (replicação) e um conjunto de RNA subgenômico (transcrição) e são usados para coordenar a expressão da ORF localizada a jusante da ORF1b (10? ? ?12).
O núcleo RTC inclui RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) (13), helicase da superfamília 1 (HEL1) (14, 15) e várias enzimas de processamento de RNA, que são codificadas principalmente em ORF1b e na família coronavírus. Contém nsp12-nsp16 e nsp9-nsp12 na família Arterioviridae (ver referência 10ââ 12).RdRp e HEL1 representam dois (um quinto) domínios conservados do vírus do ninho de pássaro e possuem homologia com outros vírus de RNA.Acredita-se que a replicase central seja auxiliada por outras subunidades, incluindo vários pequenos nsps liberados da região carboxi-terminal (C-terminal) de pp1a, a jusante de Mpro (coronavírus nsp5 e vírus arterial nsp4, respectivamente).Têm protecção limitada específica da família e actividades diversas (revisto na referência 10–12).
Relativamente recentemente, um domínio com características únicas de motivo de sequência foi encontrado no terminal amino (terminal N) adjacente ao RdRp em todos os vírus aninhados, mas em nenhum outro vírus de RNA (16).Com base em sua localização e atividade da transferase de nucleotídeo (nucleosídeo monofosfato [NMP] transferase), este domínio é denominado NiRAN (nucleotídeo transferase relacionado ao Nestvirus RdRp).A combinação de domínio duplo de NiRAN-RdRp constitui nsp12 na família Coronaviridae e nsp9 na família Arterioviridae, e em outros nestoviridae, espera-se que NiRAN-RdRp seja liberado como um nsp independente da poliproteína viral.No coronavírus, o domínio NiRAN contém ??1/450 resíduos e está conectado ao domínio RdRp C-terminal através da região ligante (16–19).No vírus da arterite equina (EAV) (Arteriviridae), o nsp9 recombinante mostra atividades de UMPilação e GMPilação dependentes de íons Mn2+ (auto), que dependem de três bases de sequência conservadas no nestovírus, AN, BN e CN Os resíduos na sequência.Onde N significa NiRAN) (16).O flanqueamento N-terminal destes motivos é um motivo préAN menos conservador.Alguns destes resíduos também são conservados em proteínas quinases distantemente relacionadas, onde foi demonstrado que estão envolvidos na ligação ao nucleosídeo trifosfato (NTP) e na atividade catalítica (20, 21).Consistente com esta observação, vários resíduos importantes do sítio ativo na pseudoquinase SelO de Pseudomonas syringae podem ser montados com o supercomplexo SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 recentemente publicado.Resíduos conservados de Coronavirus NiRAN sobrepostos na microestrutura eletrônica.Proteína recombinante (17).Especula-se que a (auto) U/GMPilação documentada produzirá um estado transitório para transferir NMP para o substrato (atualmente desconhecido) (16), e a semelhança estrutural entre NiRAN e proteína quinase (17, 19)) é a hipótese de que NiRAN modifica outras proteínas.
Muitas características, incluindo sua associação sistemática única e única com vírus aninhados e separação genética de RdRp, tornam o NiRAN uma enzima reguladora chave razoável para vírus aninhados, o que é crítico para seu surgimento e identidade.Anteriormente, foram chamadas três funções possíveis envolvendo NiRAN para regular a tradução genômica/subgenômica ou replicação/transcrição.Ao considerar os dados escassos e incompletos disponíveis na época, cada função tem suas vantagens e desvantagens (16).Nesta investigação, pretendemos combinar os estudos bioquímicos e de genética reversa dos coronavírus que representam os dois géneros, e colocar as nossas descobertas no contexto evolutivo da mutação natural da família dos coronavírus, de modo a obter uma visão deste reino misterioso.Relatamos grandes avanços na compreensão do NiRAN através da identificação de alvos naturais no RTC, o que (entre as três hipóteses disponíveis) contribui para o papel deste domínio no início da síntese de RNA de vírus aninhados.Esta pesquisa também abre possibilidades para outras funções do NiRAN na interface do host do vírus.
A fim de caracterizar as propriedades enzimáticas do domínio NiRAN relacionado ao vírus corona nsp12, produzimos uma forma recombinante de coronavírus humano 229E (HCoV-229E) nsp12 em E. coli, com uma etiqueta His6 no terminal C, e combinamos o proteína com [α32-P] Incubar juntamente com NTP na presença de MnCl2 conforme descrito em Materiais e Métodos.A análise do produto da reação indicou a presença de uma proteína radiomarcada co-migrando com nsp12 (106 kDa), indicando que o coronavírus nsp12 catalisa a formação de adutos covalentes proteína-NMP, preferencialmente formados com monofosfato de uridina (UMP) (Figura 1A) e B).A análise quantitativa mostrou que, em comparação com outros nucleotídeos, a intensidade do sinal de incorporação de UMP aumentou 2 a 3 vezes (Figura 1C).Estes dados são consistentes com a atividade prevista da NMP transferase do domínio NiRAN do coronavírus (16), mas indicam que as preferências de nucleotídeos do domínio NiRAN do coronavírus e do vírus arterial são diferentes.
Atividade de auto-NMPilação de HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) foi incubado com o designado [α-32P] NTP na presença de MnCl2 6 mM durante 30 minutos (ver Materiais e Métodos para obter detalhes).Os produtos da reação foram separados por SDS-PAGE e corados com azul brilhante de Coomassie.(B) A proteína radiomarcada é visualizada por imagens de fósforo.As posições dos marcadores de massa molecular nsp12-His6 e proteica (em quilodaltons) são mostradas em A e B. (C) A intensidade do sinal radioativo (média ± SEM) foi determinada a partir de três experimentos independentes.*P≤0,05.A intensidade do sinal (porcentagem) está relacionada ao UTP.
Embora as atividades enzimáticas relacionadas ao NiRAN tenham demonstrado ser essenciais para a replicação de EAV e SARS-CoV em cultura de células (16), a função específica do NiRAN e os alvos potenciais ainda não foram determinados.A semelhança estrutural recentemente relatada entre o NiRAN e uma família de proteínas com dobras semelhantes à proteína quinase (17, 22) nos levou a testar a hipótese de que o NiRAN catalisa a NMPilação de outras proteínas.Geramos um conjunto de potenciais alvos homólogos, incluindo proteínas não estruturais codificadas por HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), cada uma contendo uma etiqueta His6 C-terminal (apêndice SI, Tabela S1), e incubar estas proteínas com trifosfato de uridina [α32-P] ([α32-P]UTP) na presença ou ausência de nsp12.A albumina sérica bovina e a proteína de fusão MBP-LacZα produzidas em E. coli serviram como controlos (Figura 2A, pistas 1 a 7).A proteína radiomarcada foi analisada por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e autorradiografia, e constatou-se que havia um forte sinal radioativo na reação contendo nsp12 e nsp9.A posição do sinal corresponde à massa molecular de nsp9, indicando UMPilação de nsp9 mediada por nsp12 (Figura 2B, faixa 7).Nenhuma outra proteína de teste foi UMPilada, o que nos levou a concluir que a nsp9 é um substrato específico da nsp12.Consistente com os dados de auto-NMPilação mostrados na Figura 1, o nsp12 é capaz de transferir todos os quatro NMPs para o nsp9, embora a eficiência seja diferente, UMP> monofosfato de adenosina (AMP)> monofosfato de guanosina (GMP)> monofosfato de citidina (CMP)) ( Foto).3A e B).Nas condições utilizadas neste ensaio (encurtar o tempo de reação e exposição, reduzir a concentração de nsp12; materiais e métodos), a auto-NMPilação de nsp12 não pôde ser detectada (comparar Figura 2B, pista 7 e Figura 1B), que provou ser um UMP eficaz (e com múltiplas rodadas) movido de nsp12 para nsp9.A atividade da UMP transferase requer a presença de íons Mn2+, como mostrado na Figura 3C, enquanto apenas uma atividade mínima da UMP transferase foi observada na presença de Mg2+, e nenhuma atividade na presença dos outros dois cátions divalentes testados.Dados semelhantes foram obtidos em ensaios de NMPilação contendo trifosfato de citidina (CTP), trifosfato de guanosina (GTP) e trifosfato de adenosina (ATP) (apêndice SI, Figura S1).
UMPilação mediada por nsp12 de HCoV-229E de nsp9.Uma série de substratos proteicos (incluindo albumina de soro bovino, MBP-lacZα e uma série de nsps de HCoV-229E marcados com His6 C-terminal codificado por ORF1a) foram usados para avaliar a atividade de UMPilação de HCoV-229E nsp12-His6⁺ mediada proteína.Incubar a proteína com [α-32P] UTP durante 10 minutos na ausência (A) ou presença (B) de nsp12 conforme descrito nos materiais e métodos.Na parte superior de A e B, é mostrado o gel de SDS-poliacrilamida corado com Coomassie Brilliant Blue, e na parte inferior de A e B, são mostrados os autorradiogramas correspondentes.A posição do marcador de massa molecular da proteína (em quilodaltons) é apresentada à esquerda.A posição de nsp12-His6 (B, topo) e o sinal radioativo observado durante a incubação de nsp12-His6 com nsp9-His6 (B, pista 7) também são indicados, o que indica que [α-32P]UMP para nsp9-His6 (12,9 kDa), o que não foi observado para outras proteínas testadas.
Caracterização bioquímica e virológica mediada por NiRAN de HCoV-229E da NMPilação de nsp9.(A e B) O papel do co-substrato de nucleotídeo usado na reação.Nsp12-His6 e nsp9-His6 são misturados e incubados na presença de diferentes [α-32P] NTPs no ensaio padrão de NMPilação.(A, topo) nsp9-His6 corado com Coomassie separado por SDS-PAGE.(A, inferior) Autoradiografia da mesma área do gel.(B) A atividade relativa (média ± SEM) na presença do cofator de nucleotídeo designado é determinada a partir de três experimentos independentes.*P≤0,05.(C) O papel dos íons metálicos.É mostrado o teste padrão de NMPilação na presença de [α-32P] UTP e diferentes íons metálicos, cada um com uma concentração de 1 mM.Em C, a parte superior, nsp9-His6 corada com Coomassie é mostrada, e em C, a parte inferior, a autorradiografia correspondente é mostrada.O tamanho da proteína marcada (em quilodaltons) é mostrado à esquerda de A e C. (D) A forma mutante de HCoV-229E nsp12-His6 carregando a substituição de aminoácido especificada está em [α-32P]UTP, conforme descrito em Materiais e Métodos.O nsp9-His6 radiomarcado produzido na reação de NMPilação é detectado por imagem de fosforilação (D, topo).A atividade relativa comparada com a proteína do tipo selvagem (wt) é mostrada em D, e a parte inferior é considerada a média (±SEM) de três experimentos independentes.Os asteriscos indicam substituições de resíduos não conservados.(E) O título de vírus no sobrenadante da cultura de células p1 obtido 24 horas após a infecção foi determinado por ensaio de placa.As substituições de códons no domínio NiRAN do mutante HCoV-229E manipulado são indicadas (a numeração dos resíduos é baseada na sua posição em pp1ab).O mutante do sítio ativo RdRp deficiente em replicação nsp12_DD4823/4AA foi usado como controle.
A fim de obter uma compreensão mais profunda do sítio ativo do NiRAN e determinar os resíduos relacionados à atividade da NMP transferase específica para nsp9, realizamos análise de mutação, na qual substituímos os resíduos conservadores nos motivos NiRAN AN, BN e CN ( 16) É Ala (apêndice SI, Figura S2).Além disso, o impacto das substituições conservadoras de Arg para Lys ou Lys para Arg foi avaliado em dois casos.Como controle (negativo), os resíduos que não são ou são menos conservados no domínio NiRAN de coronavírus e outros vírus aninhados são substituídos por Ala. Substituindo K4116A (no motivo preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motivo BN) e D4280A (CN) reduzem significativamente ou até eliminam a NMPilação de nsp9 através de nsp12, enquanto proteínas com substituições conservadoras (R4178K, K4116R) retêm 60% e 80% de sua atividade, o que indica que o relaxamento das restrições em seu respectivo lado cadeias é físico-quimicamente sensível (Figura 3D).A substituição de vários outros resíduos conservados E4145A, D4273A, F4281A e D4283A é muito menos prejudicial, e a UMPilação de nsp9 é apenas moderadamente reduzida.Resultados semelhantes foram obtidos em reações de NMPilação de nsp9 envolvendo outros NTPs (Figura 3D e apêndice SI, Figura S3), confirmando que os efeitos observados nas substituições específicas de aminoácidos são independentes do tipo de co-substrato de nucleotídeo utilizado.A seguir, testamos o possível impacto dessas substituições de nsp12 na replicação de coronavírus em cultura celular.Para este fim, utilizámos modelos apropriados de ADN complementar geneticamente modificado (ADNc) clonados em vírus vaccinia recombinante (23, 24) para transcrever 5-7 células.A titulação da progênie de vírus infecciosos produzida nessas células mostrou que a maioria dos mutantes HCoV-229E NiRAN não eram viáveis (Figura 3E).Um grupo de mutantes virais não viáveis inclui alternativas que demonstraram eliminar ou reduzir significativamente a atividade da NMP transferase in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), mas existem duas outras alternativas (K4116R, E4145A) 80 % reservado?A sua actividade de NMPilação in vitro sugere que estão envolvidas restrições adicionais.Da mesma forma, duas outras mutações (R4178K, F4281A) que causaram uma diminuição moderada na atividade de NMPilação in vitro do NiRAN produziram vírus vivos, no entanto, estes vírus reduziram significativamente os títulos através da replicação.Consistente com os dados de atividade in vitro mostrados na Figura 3D, a substituição de quatro outros resíduos que não são conservados em coronavírus e/ou outros vírus aninhados (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) produziu vírus viáveis. um título moderadamente reduzido em comparação com o vírus do tipo selvagem (Figura 3E).
A fim de estudar se a atividade da NMP transferase mediada por NiRAN depende do domínio RdRp ativo, os dois resíduos Asp conservados envolvidos na coordenação de íons metálicos divalentes (11) no motivo RdRp C foram substituídos por Ala. sua atividade de NMPilação de nsp9, indicando que a atividade de NMPilação de nsp9 in vitro mediada por nsp12 não requer atividade de polimerase (Apêndice SI, Figura S4).
Depois de estabelecer a atividade da NMP transferase específica para nsp9 para nsp12, tentamos caracterizar o aduto NMP-nsp9 por espectrometria de massa (MS).O espectro de massa proteica completo do HCoV-229E nsp9 recombinante mostrou um pico em 12.045 Da (Figura 4A).A adição de nsp12 não alterou a qualidade da nsp9, indicando que nsp12 e nsp9 não formariam um complexo estável nas condições utilizadas (desnaturação) (Figura 4A).Na presença de UTP e GTP, a medição de massa da reação contendo nsp9 e nsp12 respectivamente mostrou que a massa proteica de UTP movimentou 306 Da, e a massa proteica de GTP movimentou 345 Da, indicando que cada molécula de nsp9 se liga a um UMP ou GMP (Figura 4) C e D).Especula-se que a energia necessária para a NMPilação de nsp9 mediada por NiRAN vem da hidrólise de NTP e da liberação de pirofosfato.Embora um excesso molar de 10 vezes de nsp9 (alvo) do que nsp12 (enzima) tenha sido usado nesta reação, foi observada NMPilação quase completa de nsp9, indicando que a interação entre nsp12 e nsp9 é de curta duração, e nsp12 pode NMPilar mais nsp9 molécula in vitro.
NMPilação única de nsp9 na presença de nsp12 e UTP ou GTP.É mostrado o espectro de massa proteica completa desconvolutada de HCoV-229E nsp9 (apêndice SI, Tabela S1) (AD).(A) nsp9 sozinho, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 na presença de UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 na presença de GTP.
Para determinar os resíduos nsp9 UMPilados por nsp12, o nsp9-UMP foi clivado com tripsina.Os peptídeos resultantes foram separados por cromatografia líquida de nano-alta eficiência (HPLC) e analisados por espectrometria de massa em tandem (MS/MS) online.A análise dos dados utilizando o pacote de software Byonic (Protein Metrics) mostrou UMPilação do aminoácido N-terminal.Isto é confirmado manualmente.O espectro de massa em tandem do peptídeo precursor [UMP] NNEIMPGK (apêndice SI, Figura S5A) revelou um fragmento a 421 m/z, indicando que o UMP se liga ao resíduo 1 do nsp9.
No terminal N do nsp9, Asn é conservado entre os membros de Orthocoronavirinae (apêndice SI, Figura S6).Embora acreditemos que o nitrogênio da amina primária N-terminal seja o aceitador mais provável para UMP, decidimos obter evidências adicionais de ligação de NMP no N-terminal.Por esta razão, o peptídeo N-terminal nsp9 não NMPilado e NMPilado purificado por HPLC foi derivado na presença de acetona e cianoborohidreto de sódio.Nestas condições, apenas aminas primárias livres podem ser modificadas com propil (25).O peptídeo derivado de nsp9 N-terminal com a sequência NNEIMPGK contém duas aminas primárias, uma no terminal N de Asn e outra na cadeia lateral de Lys no terminal C.Portanto, grupos propil podem ser introduzidos em ambas as extremidades.Os cromatogramas iônicos extraídos de peptídeos não NMPilados são mostrados no apêndice SI, Figura S5B.Como esperado, peptídeos N-terminais e C-terminais (mono)propilados (apêndice SI, Figura S5B, faixa superior) e dipropilados (apêndice SI, Figura S5B, faixa inferior) podem ser identificados.Este padrão muda com o uso do peptídeo N-terminal NMPilado de nsp9.Neste caso, apenas os peptídeos propilados C-terminais podem ser identificados, mas os peptídeos propilados N-terminais e os peptídeos dipropilados não são identificados (Apêndice SI, Figura S5C), indicando que o UMP foi transferido para a amina primária N-terminal. grupo de fazer alterações.
Em seguida, substituímos (por Ala ou Ser) ou excluímos os resíduos conservados no terminal N do nsp9 para definir restrições específicas do alvo.Com base em nossos dados de MS mostrando que NiRAN forma um aduto nsp9-NMP com a amina primária do resíduo N-terminal de nsp9, levantamos a hipótese de que a NMPilação de nsp9 requer a protease mestre viral (Mpro, nsp5) para liberar o N-terminal nsp9 de seu precursor poliproteico.Para testar esta hipótese, produzimos uma proteína precursora nsp7-11 contendo nsp9 em E. coli e realizamos um teste padrão de NMPilação na presença de [α-32P] UTP (materiais e métodos).Como mostrado na Figura 5A (pista 3), o precursor nsp7-11 não cortado não é radiomarcado com nsp12.Em contraste, se nsp7-11 for clivado por nsp5 recombinante para liberar nsp9 (e outras nsp9) do precursor, uma proteína radiomarcada que migra com nsp9 é detectada, confirmando nossa conclusão de que NiRAN e formação N-seletiva de adutos covalentes nsp9-NMP .A amina primária terminal do Asn N-terminal (posição 3825 em pp1a/pp1ab).Esta conclusão também é apoiada por experiências utilizando a construção nsp9, que contém um ou dois resíduos adicionais no terminal N.Em ambos os casos, a UMPilação de nsp9 mediada por NiRAN foi abolida (Apêndice SI, Figura S7).Em seguida, produzimos uma proteína com um ou dois resíduos Asn deletados da sequência peptídica 3825-NNEIMPK-3832 no N-terminal da nsp9.Em ambos os casos, a UMPilação da nsp9 foi completamente bloqueada (Figura 5B), fornecendo evidências adicionais de que o verdadeiro terminal N da nsp9 atua como um receptor de NMP.
O processamento proteolítico da nsp9 e o papel dos resíduos N-terminais na UMPilação mediada pela nsp12.(A) UMPylation nsp9 requer um N-terminal nsp9 livre.Nsp7-11-His6 é pré-incubado a 30 °C em tampão de detecção de NMPilação contendo UTP na presença ou ausência de Mpro recombinante (nsp5-His6).Após 3 horas, inicie o ensaio de NMPilação adicionando nsp12-His6 conforme descrito em Materiais e Métodos.A reação contendo nsp5-His6 (pista 1) e nsp9-His6 (pista 2) foi usada como controle.Após 10 minutos, a reação foi encerrada e a mistura reacional foi separada por SDS-PAGE.A proteína foi corada com Coomassie Brilliant Blue (A, topo).O precursor Nsp7-11-His6 e o produto processado resultante da clivagem mediada por nsp5-His6 são mostrados à direita.Observe (devido ao seu pequeno tamanho) que nsp7 e nsp11-His6 não são detectáveis neste gel, e a reação é complementada com nsp5-His6 (pistas 1 e 4; a posição de nsp5-His6 é indicada por um círculo sólido) ou nsp9-His6 (Faixa 2) contém uma pequena quantidade de MBP (indicada por círculos abertos) como impurezas residuais porque são expressas como proteínas de fusão de MBP (apêndice SI, Tabela S1).(B) A variante Nsp9-His6 não possui um ou dois resíduos Asn N-terminais (numeração dos resíduos de acordo com a posição em pp1a/pp1ab) e é purificada e incubada com nsp12-His6 e [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE corado com Coomassie é mostrado na parte superior, B, a autorradiografia correspondente é mostrada na parte inferior.A posição do marcador de peso molecular (em quilodaltons) é mostrada à esquerda.(C) Os resíduos conservados no terminal N de HCoV-229E nsp9-His6 foram substituídos por Ala ou Ser, e a mesma quantidade de proteína foi usada na reação de UMPilação mediada por nsp12-His6.Os produtos da reação foram separados por SDS-PAGE e corados com Coomassie Brilliant Blue (C, topo), e nsp9-His6 radiomarcado foi detectado por imagem de fosforescência (C, meio).Utilizando proteína de tipo selvagem (wt) como referência (definida para 100%), a atividade relativa de NMPilação (média ± SEM) foi calculada a partir de três experimentos independentes.(D) Os títulos de vírus no sobrenadante da cultura de células p1 de células Huh-7 infectadas com células Huh-7 de tipo selvagem HCoV-229E e mutantes que transportam substituições de aminoácidos designadas em nsp9 foram determinados por ensaio de placas.O mutante duplo DD4823 / 4AA do motivo C de RdRp com deficiência de replicação foi utilizado como controle negativo.
O terminal N do nsp9 (especialmente as posições 1, 2, 3 e 6) é muito conservado entre os membros da subfamília Orthocoronavirinae (apêndice SI, Figura S6).A fim de estudar o possível papel destes resíduos na NMPilação de nsp9 mediada por nsp12, dois resíduos Asn consecutivos no terminal N de nsp9 foram substituídos por Ala ou Ser (sozinhos ou em combinação).Em comparação com o nsp9 de tipo selvagem, a substituição do N3825 por Ala ou Ser resultou em uma redução de mais de duas vezes na UMPilação mediada por nsp12 (Figura 5C).Consistente com a nossa conclusão de que a NMPilação ocorre na amina primária N-terminal em vez da cadeia lateral do resíduo N-terminal, observamos NMPilação residual significativa com a substituição de N3825A e N3825S.Curiosamente, se o segundo Asn for substituído por Ala ou Ser, a UMPilação de nsp9 é reduzida mais fortemente (mais de 10 vezes), enquanto a substituição de Ala nas posições 3, 4 e 6 tem apenas um efeito moderado na UMPilação de nsp9 (Figura 2 ).5C).Resultados semelhantes foram obtidos usando ATP, CTP ou GTP (apêndice SI, Figura S8).Coletivamente, esses dados indicam o papel fundamental do N2826 (posição 2 na nsp9) na NMPilação da nsp9.
A fim de obter evidências adicionais da correlação funcional entre o terminal N da nsp9 e a NMPilação, realizamos um alinhamento de múltiplas sequências (MSA) da sequência nsp9 da família Coronavirus (variando entre 104 e 113 resíduos) (Apêndice SI, Figura S6).No total, em 47 espécies (conhecidas e supostas) de 5 gêneros da subfamília Orthocoronavirinae que infectam diferentes mamíferos, aves e répteis hospedeiros, apenas 8 resíduos no total foram considerados invariantes.As alterações mais extensas, incluindo deleções e inserções, foram observadas nos ciclos entre os elementos da estrutura secundária do nsp9, conforme determinado por estudos estruturais anteriores (26 ??28).Cinco resíduos invariantes foram encontrados na cadeia β e na hélice α da parte C-terminal da nsp9.Três resíduos invariantes constituem o motivo NNE do terminal N da nsp9.É revelado que o segundo Asn deste motivo é o único resíduo invariante, que também é compartilhado pelo hipotético nsp9 do coronavírus de sapo distantemente relacionado, e representa a espécie Microhyla letovirus 1 na subfamília Letovirinae de Alphaletovirus.A conservação de resíduos em elementos da estrutura secundária de nsp9 pode ser racionalizada por considerações estruturais para manter propriedades de dobramento ou de ligação ao RNA conhecidas.No entanto, este raciocínio não parece aplicar-se à conservação do NNE, e antes deste estudo, a natureza das restrições que limitam a variação da sequência tripeptídica foi completamente obscurecida.
A fim de determinar a importância da NMPilação da nsp9 e da conservação do NNE na replicação do coronavírus, produzimos mutantes HCoV-229E, que transportam substituições simples ou duplas de resíduos N-terminais da nsp9, indicando que a NMPilação da nsp9 é prejudicial in vitro.Antes de começarmos, tentamos responder à questão de saber se estas substituições (perto do local de clivagem nsp8 | 9) afetam o processamento proteolítico da região C-terminal pp1a.Um conjunto de construções de poliproteína nsp7-11 contendo substituições correspondentes no terminal N de nsp9 foi produzido em E. coli e cortado com Mpro recombinante.A clivagem proteolítica dos quatro locais (incluindo o local flanqueador de nsp9) não é significativamente afetada por quaisquer substituições introduzidas (apêndice SI, Figura S9), excluindo alterações estruturais nestas proteínas que interferem na clivagem de nsp8|9 mediada por Mpro (ou outro) local na rede Internet.
Células Huh-7 foram transfectadas com RNA HCoV-229E de comprimento genômico, codificando substituições Ala ou Ser nos tripéptidos NNE conservados (N3825, N3826 e E3827) no terminal N nsp9, mostrando que a maioria das mutações são fatais.Conseguimos resgatar o vírus substituindo o Ser ou Ala do Asn N-terminal (N2835A ou N2835S), mas não conseguimos recuperar o vírus com outras mutações simples e duplas na sequência NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figura 5D).
Estes resultados indicam que a replicação dos coronavírus na cultura de tecidos é restrita (igual ou semelhante), limitando a mutação natural dos locais de NMPilação da nsp9 no corpo e apoiando o papel fundamental desta resposta no ciclo de vida dos coronavírus.
No último conjunto de experimentos, produzimos His6 C-terminal marcado como SARS-CoV-2 nsp12 e nsp9, e duas formas mutantes de nsp12 em E. coli.Os resíduos do sítio ativo nos domínios NiRAN e RdRp foram respectivamente Use Ala (Figura 6A e apêndice SI, Tabela S2).K4465 no SARS-CoV-2 nsp12 corresponde a K4135 no HCoV-229E (Apêndice SI, Figura S2), que provou ser necessário para a atividade do NiRAN e replicação do HCoV-229E (Figura 3D e E).Este resíduo também corresponde ao resíduo nsp9 K94 do vírus arterial EAV, que foi previamente demonstrado ser necessário para a auto-UMPilação / auto-GMPilação do NiRAN (16).Conforme mostrado na Figura 6B, o nsp12 do SARS-CoV-2 tem atividade de transferase UMP usando nsp9 como substrato, enquanto o mutante do sítio ativo nsp12_K4465A é inativo.A dupla substituição na sequência característica SDD do motivo C de RdRp não afeta a atividade da UMP transferase (Figura 6B), indicando que a atividade de RdRp não tem efeito direto na UMPilação de nsp9.Dados semelhantes foram obtidos utilizando CTP, GTP e ATP (apêndice SI, Figura S10).Em resumo, estes dados indicam que a NMPilação de nsp9 mediada por NiRAN tem uma atividade conservadora em coronavírus representando diferentes gêneros da subfamília de ortocoronavírus.
NMPilação de nsp9 mediada por SARS-CoV-2 nsp12.(A) Gel de SDS-poliacrilamida corado com Coomassie mostrando a proteína recombinante usada no teste de NMPilação.Como controle, foi utilizada uma proteína mutante com substituição de sítio ativo no domínio NiRAN (K4465A) e no domínio RdRp (DD5152/3AA) do SARS-CoV-2 nsp12.A numeração dos resíduos é baseada na posição em pp1ab.(B) Autoradiografia de detecção de UMPilação usando nsp9-His6 e [α-32P]UTP como substrato de nsp12-His6 (tipo selvagem [wt] e mutante).A massa molecular (em quilodaltons) da proteína marcada é mostrada à esquerda.
Os domínios NiRAN são geralmente conservados em Nidovirales (16), indicando que eles catalisam reações enzimáticas essenciais para a replicação do Nidovírus.Neste estudo, conseguimos provar que o domínio NiRAN do coronavírus transfere NMP (gerado a partir de NTP) para nsp9, uma misteriosa proteína de ligação ao RNA envolvida na replicação do vírus (26 ?? 29), para determiná-lo como um alvo natural e parceiro do coronavírus RTC.
O domínio NiRAN compartilha três motivos de sequência (AN, BN e CN), que contêm um número muito pequeno de resíduos que são conservados em todas as famílias na ordem Nidovirales monofilética, mas altamente diferenciada (8, 16).Estudos recentes mostraram que eles estão estruturalmente relacionados a uma família amplamente descaracterizada de proteínas semelhantes à proteína quinase, que foram originalmente chamadas de família SelO (17, 19, 22, 30, 31).As proteínas relacionadas ao SelO possuem dobras de quinase, mas carecem de vários resíduos conservados do sítio ativo nas quinases clássicas (22, 32).Com base na orientação reversa das moléculas de ATP ligadas ao sítio ativo e estabilizadas por interações específicas, a SelO foi hipotetizada e posteriormente confirmada para transferir AMP (em vez de fosfato) para o substrato proteico (22), enquanto outra proteína bacteriana semelhante a SelO YdiU tem recentemente foi demonstrado que catalisa a ligação covalente de UMP a resíduos Tyr e His de diferentes substratos proteicos (33).
A fim de confirmar e expandir a previsão dos supostos resíduos do sítio ativo do domínio NiRAN do coronavírus, utilizamos métodos bioquímicos e de genética reversa para realizar análise de mutação no coronavírus nsp12 (Figura 3D e E e apêndice SI, Figura S3 e tabela) S1â S4).Os dados mostram que a substituição de HCoV-229E K4135, R4178 e D4280 por Ala elimina a atividade in vitro da NMP transferase e a replicação do vírus na cultura celular (Figura 3D e apêndices E e SI, Figura S3), apoiando sua presença em NTP γ-fosfato (K4135, R4178) e a coordenação de íons metálicos do sítio ativo (D4280).A substituição E4145A do Glu conservado na faixa do vírus do ninho de pássaro previsto para estabilizar a posição K4135 (17) mostrou eliminar a replicação viral, mas surpreendentemente, a atividade foi retida no ensaio de NMPilação in vitro (Figura 3D e E e Apêndice SI, Figura S3 e Tabelas S1–S4).Uma observação semelhante foi feita quando a substituição correspondente foi introduzida no homólogo YdiU de Salmonella typhimurium (E130A) (33).Tomados em conjunto, estes dados apoiam a função reguladora deste resíduo conservado, em vez da função catalítica.
A substituição do resíduo Phe conservado (F4281A) dentro da faixa de nestovírus no domínio HCoV-229E NiRAN (8) resultou em uma diminuição na atividade de NMPilação in vitro e uma diminuição significativa na replicação do vírus em cultura celular (Figura 3D, E e SI) apêndice, Figura S3).Os dados são consistentes com a importante função reguladora deste resíduo, tal como o resíduo Phe do motivo DFG homólogo mostrado anteriormente.Nas proteínas quinases clássicas, faz parte da alça de ligação do Mg2+ e ajuda a montar e regular a coluna vertebral???Necessário para atividade catalítica eficaz (32, 34).A substituição de resíduos K4116 por Ala e Arg (no motivo preAN), respectivamente, eliminou a replicação viral e, como esperado, teve efeitos diferentes na atividade da NMP transferase in vitro, dependendo da cadeia lateral de aminoácidos introduzida (Figura 3D e apêndices E e SI , Figura S3).Os dados funcionais são consistentes com as informações estruturais, indicando que este resíduo estabeleceu interação com ATP fosfato (17).No domínio NiRAN de outras famílias de vírus aninhados, a posição de HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 é ocupada por Lys, Arg ou His (8), indicando que a restrição funcional deste resíduo específico foi relaxada.A substituição de D4188A e D4283A elimina ou reduz fortemente a atividade enzimática e elimina a replicação do vírus (Figura 3).Estes dois resíduos são conservados na maioria (mas não em todos) dos vírus aninhados (8), indicando uma importante função específica da família, mas possivelmente não catalítica.Substituições Ala de vários outros resíduos Lys e Asp (K4113A, D4180A, D4197A e D4273A) que não são conservados nos Coronaviridae ou outras famílias Nestioviridae (8) foram utilizadas como controlos.Como esperado, estas substituições são amplamente toleráveis, com uma ligeira diminuição na atividade enzimática e na replicação viral em alguns casos (Figura 3 e apêndice SI, Figura S3).No geral, os dados de mutagênese do coronavírus são muito consistentes com os dados de auto-GMP e genética reversa do EAV NiRAN-RdRp (16), no qual o resíduo K94 do EAV nsp9 (coronavírus nsp12 ortólogo) (correspondente ao HCoV-229E K4135) funções importantes), R124 (correspondente a R4178), D132 (correspondente a D4188), D165 (correspondente a D4280), F166 (correspondente a F4281).Além disso, os dados de mutagênese do HCoV-229E são consistentes e expandidos a partir dos dados de genética reversa do SARS-CoV relatados anteriormente (16), igualmente semelhantes aos observados para o motivo CN correspondente do mutante Phe-to-Ala SARS-CoV_nsp12. fenótipo descrito -F219A e HCoV-229E_F4281A (Figura 3 D e E e apêndice SI, Figura S3 e Tabela S1-S4).
Em comparação com os ortólogos EAV (16), que têm uma clara preferência por UTP e GTP (na reação de auto-NMPilação), nosso estudo mostra que o domínio NiRAN do coronavírus (representado por HCoV-229E e SARS-CoV-2) pode ser efetivamente transferidos Todos os quatro NMPs, embora haja uma ligeira preferência pelo UMP (Figuras 1 e 3).A especificidade relativamente baixa do co-substrato específico de NTP é consistente com a estrutura supercomposta SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 recentemente relatada, na qual ADP-Mg2+ se liga ao sítio ativo de NiRAN, mas não com adenina. da formação de interações específicas (17).Em nosso estudo, o tipo de nucleotídeo utilizado na reação de NMPilação não tem efeito diferencial na atividade da proteína mutante (Apêndice SI, Figura S3), indicando que nenhum desses resíduos está intimamente relacionado à ligação de uma nucleobase específica.A base estrutural e o potencial significado biológico das diferentes preferências de co-substrato de NTP observadas nos domínios NiRAN de coronavírus e vírus arteriais ainda precisam ser estudados;eles podem ser verdadeiros ou devido às limitações de seus respectivos estudos.Actualmente, não se pode excluir que a potencial actividade NMPiladora do domínio NiRAN do vírus arterial (em comparação com a actividade de auto-NMPilação anteriormente caracterizada) tenha uma preferência diferente de co-substrato, tendo em conta que a semelhança entre o domínio arterial e o coronavírus O domínio NiRAN está no seu limite.Comparação baseada em sequência (16).Em comparação com a pseudoquinase SelO, que utiliza Mg2+ como cofator, a atividade do coronavírus e do vírus arterial NiRAN é dependente de Mn2+ (16) (Figura 3C e apêndice SI, Figura S1).A dependência de Mn2+ e a preferência óbvia por UTP é uma característica incomum dos NMPylators de proteínas, e só recentemente foi confirmada na proteína YdiU de Salmonella typhimurium, que catalisa a UMPilação da proteína chaperone estritamente dependente de Mn2+ para proteger as células da indução de estresse. 33).
A semelhança estrutural recentemente descrita entre o domínio NiRAN do coronavírus e as proteínas quinases celulares (17, 19) fornece suporte adicional para a capacidade do NiRAN de ligar covalentemente a NMP a outras proteínas que relatamos neste estudo.Concentramos nossa busca por possíveis alvos NiRAN nas proteínas codificadas por HCoV-229E ORF1a, que são conhecidas por auxiliar direta ou indiretamente a replicase codificada por ORF1b do RTC (12, 35).Nossos experimentos fornecem evidências conclusivas para a NMPilação eficaz e específica da nsp9 (Figura 2).Se a proteína alvo for utilizada em excesso molar 8 a 10 vezes maior que o da enzima (nsp12), confirma-se que a nsp9 é completamente (mono)NMPizada (Figura 4).Concluímos que a interação entre nsp12 e nsp9 é de curta duração e não formará um complexo estável com nsp9 (na ausência de outras subunidades RTC).Esta conclusão é apoiada por estudos de interação proteica no proteoma SARS-CoV (35).A análise MS identificou a amina primária do resíduo N-terminal de nsp9 como o local de NMPilação (apêndice SI, Figura S5).A formação da ligação fosforamidato e do grupo amino N-terminal distingue a atividade de NMPilação mediada por NiRAN da reação de AMPilação mediada por SelO de Pseudomonas syringae, que catalisa a formação de AMP ligado a O nos resíduos Ser, Thr ou Tyr Aduto peptídico ( 22), e S. typhimurium YdiU forma adutos de peptídeo-UMP ligados a O (com Tyr) e ligados a N (com His).A informação limitada disponível sobre a família de proteínas SelO indica que os membros desta grande família de proteínas diferem grandemente na formação de adutos peptídeo-NMP.Esta é uma observação interessante que merece um estudo mais aprofundado.
Os dados obtidos neste estudo nos levaram a levantar a hipótese de que a NMPilação da nsp9 requer um terminal N livre.No contexto da replicação viral, esta será proporcionada pela clivagem proteolítica do sítio de processamento nsp8|nsp9 na poliproteína replicase pp1a mediada por Mpro e pp1ab.Na maioria dos coronavírus, a diferença entre este sítio específico (VKLQ|NNEI em HCoV-229E) e todos os outros sítios de clivagem Mpro do coronavírus é Asn (em vez de outro pequeno resíduo, como Ala, Ser ou Gly) ocupar P1â???Localização (36).Os dados de clivagem peptídica obtidos nos primeiros estudos mostraram que a eficiência de clivagem do sítio nsp8 | nsp9 foi menor do que a de outros sítios, indicando que 1) este sítio específico pode ter um papel regulador no processamento coordenado e oportuno do C-terminal região pp1a, ou 2) a O papel do N-terminal nsp9 especial conservado na replicação do vírus (37).Nossos dados (Figura 5A) mostraram que a forma recombinante de nsp9 transportando a sequência N-terminal real foi efetivamente NMPizada pela nsp12.A sequência flanqueadora N-terminal foi removida pelo fator Xa (nsp9-His6; apêndice SI, Tabela S1) ou clivagem mediada por Mpro (nsp7-11-His6; Figura 5A e apêndice SI, Tabela S1).É importante ressaltar que o precursor nsp7-11-His6 contendo nsp9 não cortado mostrou resistência à NMPilação de nsp12, o que é consistente com nossos dados, indicando que o aduto nsp9-NMP é formado através da amina primária N-terminal (apêndice SI, Figura S5) .Para obter uma compreensão mais profunda da especificidade do substrato NiRAN, focamos então nos resíduos N-terminais adjacentes da nsp9.Na ausência de outras proteínas, elas são estruturalmente flexíveis, impedindo que sejam detectadas na forma não marcada de nsp9 (26 28, 38), indicando sua variação natural limitada. função do fragmento N-terminal nsp9.Substituições Ala de resíduos conservados nesta região (Figuras 5C e D e apêndice SI, Figura S8) revelam que N3826 é essencial para NMPilação de nsp9 in vitro, enquanto substituições N3825A e E3827A levam a uma diminuição na NMPilação, enquanto substituições M3829A e P3830A não .Obviamente afeta a NMPilação do nsp9.Embora a substituição de Asn N-terminal (N3825A, N3825S) tenha apenas um efeito moderado na NMPilação de nsp9 e na replicação do vírus em cultura celular (Figura 5C e D), a deleção de uma sequência de resíduos Asn do dipeptídeo 3825-NN N-terminal provou ser letal para os vírus, indicando que um resíduo Asn é necessário antes de outro resíduo no terminal N, preferencialmente Asn, embora pareça que a substituição de resíduos semelhantes possa ser parcialmente tolerada (Figura 5B, C e D).Concluímos que o dipeptídeo 3825-NN, especialmente o resíduo N3826 conservado e essencial dentro da faixa do coronavírus (apêndice SI, Figura S6), garante a correta ligação e orientação do terminal N da nsp9 no sítio ativo do NiRAN.
A substituição de Ala (E3827A) pelo Glu conservado de todas as subfamílias retém a NMPilação de nsp9 in vitro, mas é letal para vírus em cultura de células (Figura 5C e D), indicando a função adicional deste resíduo, por exemplo, em interações chave (NMPilado ou não modificado ) nsp9 N-terminal e outros fatores envolvidos na replicação do vírus.As mutações Nsp9 não afetaram o processo proteolítico de nsp9 ou qualquer nsps adjacente (39) (Apêndice SI, Figura S9), indicando que os fenótipos letais de várias mutações nsp9 observadas não foram causados pela desregulação da área pp1a terminal do processo proteolítico C .
Os dados acima fornecem evidências de que após o tratamento mediado por Mpro do local de clivagem de nsp8|9 em pp1a/pp1ab, o terminal N de nsp9 pode ser UMPilado (ou parcialmente modificado com outro NMP).Além disso, a excelente conservação do terminal N da nsp9 (incluindo os resíduos Asn singulares e invariantes na família dos coronavírus) e os dados de genética reversa obtidos neste estudo (Figuras 3E e 5D) nos levaram a concluir que a NMPilação da nsp9 descrita é biologicamente relacionado e essencial para a replicação do coronavírus.As consequências funcionais desta modificação ainda precisam ser estudadas, por exemplo, em relação à atividade de ligação ao RNA da nsp9 (forma não modificada) previamente descrita (não específica) (2628).A NMPilação N-terminal também pode afetar a interação da nsp9 com substratos proteicos ou de RNA ou a formação de diferentes conjuntos de quatro níveis.Estes foram observados em estudos estruturais e foram confirmados como estando funcionalmente relacionados com a replicação do coronavírus, embora especialmente na ausência de No caso desta modificação (26-ââ29, 40).
Embora a especificidade alvo do domínio NiRAN do coronavírus ainda precise ser caracterizada com mais detalhes, nossos dados mostram que a especificidade do alvo proteico do domínio NiRAN do coronavírus é muito estreita.Embora a conservação dos principais resíduos do sítio ativo (8, 16) no domínio NiRAN de todas as famílias de nidovírus apóie fortemente a atividade do NMPylator conservado dessas proteínas, a identidade dos resíduos de bolso de ligação ao substrato deste domínio Conservação e conservação ainda precisam ser caracterizadas , e pode diferir entre diferentes famílias de propósitos de Nidovirales.Da mesma forma, os alvos relevantes de outros vírus aninhados ainda não foram determinados.Eles podem ser ortólogos remotos de nsp9 ou outras proteínas, porque as sequências fora dos cinco domínios de replicase que são geralmente conservadas em vírus aninhados são menos conservadas (8), incluindo o arranjo do genoma entre Mpro e NiRAN. Entre eles, nsp9 está localizado no coronavírus.
Além disso, atualmente não podemos descartar a possibilidade de o domínio NiRAN ter alvos adicionais (incluindo celulares).Neste caso, vale ressaltar que os homólogos bacterianos nesta proteína emergente NMPylators (NMPylators) (30, 31) parecem ter “reguladores mestres”?A NMP modula uma variedade de proteínas celulares para regular ou eliminar as suas actividades a jusante, desempenhando assim um papel numa variedade de processos biológicos, tais como resposta ao stress celular e homeostase redox (22, 33).
Neste estudo (Figuras 2 e 4 e Apêndice SI, Figuras S3 e S5), conseguimos provar que a nsp12 transferiu a parte UMP (NMP) para uma posição única (conservada) na nsp9, enquanto outras proteínas não foram modificadas no usado Nessas condições, a especificidade do substrato bem definida (em vez de solta) é suportada.Consistente com isso, em comparação com a NMPilação de nsp9 N-terminal, a atividade de NMPilação da própria nsp12 é muito baixa, sua detecção requer um tempo de exposição de autorradiografia mais longo e um aumento de 10 vezes na concentração de nsp12 é usado.Além disso, nossa análise de MS não conseguiu fornecer evidências de NMPilação de nsp12, o que sugere que a auto-NMPilação do domínio NiRAN é (na melhor das hipóteses) uma atividade secundária.No entanto, deve-se notar que outros estudos forneceram evidências preliminares de que o estado de auto-AMPilação do NMPylator bacteriano pode controlar a sua atividade de NMPilação em outros substratos proteicos (22, 33).Portanto, mais pesquisas são necessárias para investigar os possíveis efeitos funcionais das atividades de auto-NMPilação relatadas para EAV nsp9 (16) e coronavírus nsp12 (este estudo), incluindo o efeito semelhante ao acompanhante proposto no dobramento do domínio RdRp C-terminal ( 16)).
Anteriormente, foram consideradas várias hipóteses sobre as possíveis funções a jusante do domínio nidoviral NiRAN, incluindo RNA ligase, guanilato transferase com RNA e atividade de priming proteico (16), mas nenhuma delas é compatível com as funções a jusante disponíveis.As informações obtidas nas posições a seguir são exatamente iguais, sem fazer suposições adicionais.Os dados obtidos neste estudo são mais consistentes (mas não podem provar) que o domínio NiRAN está envolvido no início da síntese de RNA induzida por proteínas.Anteriormente, acreditava-se que a função do domínio NiRAN em 5??As reações de capeamento de ²-RNA ou de ligação de RNA não são afetadas por estes e pelo suporte de outros dados.Portanto, por exemplo, considera-se que o sítio ativo do NiRAN envolve o Asp conservado como base geral (D252 em Pseudomonas syringae SelO; D4271 em HCoV-229E pp1ab; D208 em SARS-CoV-2 nsp12) (SI Apêndice, figura 2 ).S2) (17, 22, 33), enquanto a catálise na RNA ligase dependente de ATP e na enzima de capeamento de RNA é realizada pelo intermediário enzima covalente-(lisil-N)-NMP, que envolve um resíduo Lys não alterado ( 41).Além disso, a notável especificidade baseada em sequência do coronavírus NiRAN para alvos proteicos conservados e a especificidade relaxada para co-substratos de NTP (prefere UTP) opõem-se à enzima de capeamento mediada por NiRAN ou a funções semelhantes a RNA ligase.
Obviamente, é necessário muito trabalho extra para verificar e, se comprovado, elaborar sobre o possível papel da nsp9-UMP (nsp9-NMP) na síntese de RNA induzida por proteínas, o que conectará vários relatórios interessantes, mas (até agora) relatados anteriormente. .Observações isoladas.Por exemplo, foi determinado que o final da cadeia negativa de RNA do coronavírus começa com uma cadeia oligo(U) (42, 43).Esta observação é consistente com a ideia de que a síntese de RNA de fita negativa é iniciada pela ligação da forma UMPilada de nsp9 à cauda poli(A) (gatilhos), que pode ser promovida por sua ligação ao RNA. A atividade e/ou interação com outra proteína RTC.A porção UMP fornecida por nsp9 pode então ser usada como um “primer” para oligouridilação mediada por nsp7/8/nsp12, usando a cauda 3??²-poli(A) no RNA genômico ou outra sequência contendo oligo (A). serve como modelo, semelhante ao mecanismo estabelecido para a proteína VPg do picornavírus (44).E se a proposta for “não normativa”????O início da síntese de ARN de cadeia negativa (induzida por proteína) fornece uma ligação às observações, indicando que o ARN de cadeia negativa do coronavírus tem UMP (em vez de UTP) no seu final (42), o que é considerado uma indicação de que o ácido nucleico Dicer cliva a extremidade fosforilada por uma endonuclease específica de uridina desconhecida.Se confirmada, esta atividade hidrolítica de ácido nucleico pode ajudar a liberar a forma oligomérica UMPilada de nsp9 da extremidade 5² da fita negativa nascente.O possível papel da nsp9 na preparação de proteínas também é consistente com estudos anteriores de genética reversa, que mostraram que a nsp9 (e a nsp8) interagem crítica e especificamente com o elemento conservado de RNA de ação cis próximo à extremidade 3 do genoma do coronavírus.45).De acordo com este relatório, estas observações anteriores podem agora ser reexaminadas e expandidas através de mais investigação.
Em resumo, nossos dados determinaram a atividade específica de uma etiqueta enzimática de vírus aninhada proprietária ligada ao RdRp no terminal N.No coronavírus, esta atividade UMPylator / NMPylator mediada por NiRAN recém-descoberta é usada para se basear em Mn2 + e resíduos Asn adjacentes e causar a formação de ligações fosforamidato (de baixa energia) com a amina primária N-terminal.Através da clivagem mediada por Mpro no local de clivagem nsp8|9, o alvo nsp9 pode ser usado para NMPilação, indicando o acoplamento funcional entre a protease e o domínio NiRAN, que se estende até RdRp.A conservação de resíduos-chave no sítio ativo nsp12 NiRAN e no alvo nsp9, combinada com dados obtidos de dois coronavírus, incluindo SARS-CoV-2, fornece fortes evidências de que a NMPilação nsp9 é um coronavírus. As características conservadoras também são uma etapa fundamental na replicação do vírus.Os dados disponíveis levam-nos a concluir que o papel específico da forma NMPilada de nsp9 na síntese de RNA induzida por proteínas é um cenário razoável para o coronavírus e outros vírus aninhados, e o NiRAN também pode ter como alvo outras proteínas não identificadas.Regular o vírus.Interação do anfitrião.Se confirmado, o envolvimento de primers proteicos na síntese de RNA viral aumentará a afinidade de sequência dos domínios Mpro/3CLpro e RdRp entre o coronavírus previamente detectado e o supergrupo semelhante ao picornavírus (9), que agora foram unificados nos recentemente estabelecidos Pisonivirites ( 46) na categoria.
Nossos dados também mostram que as atividades enzimáticas básicas, seletivas e conservadoras identificadas neste estudo podem ser utilizadas como alvos para medicamentos antivirais.Compostos que interferem na ligação (e subsequente modificação) do terminal N da nsp9 conservado no sítio ativo do NiRAN podem ser desenvolvidos em medicamentos antivirais eficazes e versáteis, adequados para o tratamento de coronavírus animais e humanos de diferentes (sub) gêneros Infecções , incluindo SARS-CoV-2 e Coronavírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio.
A sequência codificadora da proteína do coronavírus produzida neste estudo foi amplificada por RT-PCR utilizando RNA isolado de Huh-7 infectado com HCoV-229E ou Vero E6 infectado com SARS-CoV-2 e inserido usando procedimentos de clonagem padrão.vetor de expressão pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) ou pASK3-Ub-CHis6 (47) (Apêndice SI, Tabelas S1 e S2).Substituições de códon único foram introduzidas por mutagênese dirigida baseada em PCR (48).Para produzir a proteína de fusão MBP, as células TB1 de E. coli foram transformadas com a construção apropriada do plasmídeo pMAL-c2 (apêndice SI, Tabela S1).A proteína de fusão foi purificada por cromatografia de afinidade com amilose e clivada com factor Xa.Posteriormente, a proteína marcada com His6 C-terminal foi purificada por cromatografia de afinidade com metal imobilizado com Ni (Ni-IMAC) como descrito anteriormente (49).Para produzir a proteína de fusão de ubiquitina, as células TB1 de E. coli utilizaram a construção de plasmídeo pASK3-Ub-CHis6 apropriada (Apêndice SI, Tabelas S1 e S2) e DNA de plasmídeo pCGI que codifica hidrolase 1 C-terminal específica de ubiquitina (Ubp1).Transformação (47).A proteína de coronavírus marcada com His6 C-terminal foi purificada como descrito anteriormente (50).
O teste de auto-NMPilação do HCoV-229E nsp12-His6 foi realizado conforme descrito em EAV nsp9 (16).Resumindo, nsp12-His6 (0,5 µM) contém ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico (HEPES)-KOH 50 mM, pH 8,0, ditiotreitol 5 mM (DTT), MnCl2 6 mM, tampão 25 µM, incubar o NTP especificado e 0,17 µM de [α32-P]NTP correspondente (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) a 30 °C por 30 minutos.Em todos os outros ensaios de NMPilação (padrão) de NMPilação de nsp9 mediada por nsp12, as condições de reação são ajustadas como se segue: nsp12-His6 (0,05 µM) e nsp9-His6 (4 µM) na presença de HEPES-KOH 50 mM (pH 8,0 ), DTT 5 mM, MnCl2 1 mM, 25 µM indicaram NTP e 0,17 µM corresponderam a [α32-P]NTP.Após incubação durante 10 minutos a 30°C, a amostra de reação foi misturada com tampão de amostra SDS-PAGE: tris(hidroximetil)aminometano HCl 62,5 mM (pH 6,8), DTT 100 mM, SDS 2,5%, glicerol 10% e bromofenol 0,005% azul.A proteína foi desnaturada por aquecimento a 90°C durante 5 minutos e separada por SDS-PAGE a 12%.O gel é fixado e corado com solução de Coomassie Brilliant Blue (40% de metanol, 10% de ácido acético, 0,05% de Coomassie Brilliant Blue R-250), descolorado e exposto a uma tela de imagem fosforescente por 20 horas (para detectar nsp12 de NMPilação) ou (máximo) 2 horas (para avaliar NMPilação nsp9).Um gerador de imagens Typhoon 9200 (GE Healthcare) foi usado para digitalizar a tela e o ImageJ foi usado para analisar a intensidade do sinal.
Para análise de MS, 1 µM de nsp12-His6 e 10 µM de nsp9 (sem marcador de hexahistidina) foram utilizados na análise de NMPilação (apêndice SI, Tabela S1) e a concentração aumentada de 500 µM de UTP e GTP foi utilizada.Dependendo de sua concentração e da qualidade proteica esperada, um sistema Waters ACQUITY H-Class HPLC equipado com uma coluna MassPrep (Waters) foi usado para dessalinizar 1 a 10 µL de soluções proteicas tamponadas online.A proteína dessalinizada é eluída na fonte de íons de eletropulverização do espectrômetro de massa Synapt G2Si (Waters) através do seguinte gradiente de tampão A (água/0,05% de ácido fórmico) e tampão B (acetonitrila/0,045% de ácido fórmico), e a temperatura da coluna é 60°C e uma taxa de fluxo de 0,1 mL/min: eluição isocraticamente com 5% de A por 2 minutos, depois um gradiente linear para 95% de B dentro de 8 minutos, e manter 95% de B por mais 4 minutos.
Íons positivos com faixa de massa de 500 a 5.000 m/z são detectados.Glu-fibrinopeptídeo B é medido a cada 45 segundos para correção automática de desvio de massa.Use o software do instrumento MassLynx com extensão MaxEnt1 para desconvolver o espectro médio após deduzir a linha de base e suavizar.
O HCoV-229E nsp9 UMPilado foi digerido pela adição de tripsina modificada de grau de sequenciamento (Serva) e incubado durante a noite a 37 ° C.Uma coluna de rotação Chromabond C18WP (número de peça 730522; Macherey-Nagel) foi usada para dessalinizar e concentrar os peptídeos.Finalmente, o peptídeo foi dissolvido em 25 µL de água, que continha 5% de acetonitrila e 0,1% de ácido fórmico.
As amostras foram analisadas por MS utilizando um espectrômetro de massa Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).O mais recente sistema nanoâ HPLC (Dionex), equipado com um painel personalizado de 50 cm montado na extremidade??Coluna C18 RP de 75 μm embalada com esferas magnéticas de 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Conecte-se ao espectrômetro de massa on-line através da fonte de nanospray Proxeon;injetar 6 μL de solução de digestão de tripsina em um diâmetro interno de 300 μm ×??Coluna de pré-concentração C18 PepMap de 1 cm (Thermo Scientific).Usando água/0,05% de ácido fórmico como solvente, a amostra foi automaticamente retida e dessalinizada a uma vazão de 6 µL/min.
Os seguintes gradientes de água/0,05% de ácido fórmico (solvente A) e 80% de acetonitrila/0,045% de ácido fórmico (solvente B) foram usados para conseguir a separação de peptídeos trípticos a uma vazão de 300 nL/min: 4% de B para 5 minutos, depois um gradiente linear de 30 A até 45% de B em minutos e um aumento linear até 95% de solvente B em 5 minutos.Conecte a coluna cromatográfica a um nanoemissor de aço inoxidável (Proxeon) e pulverize o eluente diretamente no capilar aquecido do espectrômetro de massa usando um potencial de 2.300 V. A varredura de pesquisa com resolução de 60.000 no analisador de massa Orbitrap está associada com pelo menos três varreduras de dados MS/MS, excluídas dinamicamente por 30 segundos, usando dissociação induzida por colisão de armadilha de íons linear ou dissociação de colisão de energia mais alta combinada com detecção orbitrap, a resolução é 7.500.
Horário da postagem: 03 de agosto de 2021